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DNAPulldown,免疫沉淀和Pulldown,这些方法原理你弄懂了吗?

发布日期:2021-09-26 23:24:20 作者: 点击:

Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作为常见的关系验证方法。它们可以从检验的出发点来区分:co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白检测体内相关蛋白、DNA、RNA,并通过蛋白抗体免疫沉淀分离目标蛋白、DNA、RNA。Pulldown则是根据已知RNA(RNA pulldown)或者已知蛋白(GST pulldown)体外检验相关蛋白。

免疫共沉淀co-IP

抗体与细胞裂解液或蛋白表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)(或二抗)偶联的琼脂糖微珠孵育,通过离心得到微珠-蛋白A/G(或二抗)-抗体-目的蛋白复合物。复合物沉淀经离心洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,沸水浴5-10 min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体(轻链和重链已断开)和靶标蛋白。该上清混合物经SDS-PAGE电泳分离和Western blotting显影,最终依据显影后的胶片上是否有目的蛋白条带,来判断免疫沉淀实验是否成功。

实验方法

Step1: 蛋白样品准备,细胞需提前裂解

Step2: 抗原抗体结合

Step3: protein A 琼脂糖珠与抗体结合

Step4: 免疫沉淀分离

Step5: 洗脱蛋白复合物

Step6: WB或质谱分析

染色质免疫沉淀ChIP

ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。在生理状态下,把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应, 将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来,以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段,再通过多种下游检测技术(定量PCR、基因芯片、测序等)来检测此富集片段的DNA序列。

实验方法

Step1: 交联蛋白与DNA

Step2: 超声破碎使染色质片段化

Step3:细胞裂解

Step4: 抗体结合特定蛋白抗原

Step5: 通过beads沉淀复合物并洗脱

Step6: qPCR扩增或基因测序

RNA免疫沉淀RIP

主要是用来研究体内RNA与蛋白结合情况,利用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,通过分离纯化,对结合在复合物上的RNA 进行RT-PCR验证或测序分析,了解转录后调控网络动态过程。

实验方法

Step1:靶蛋白-RNA交联形成复合物(RNP)超声剪切RNA链成小段

Step2:细胞裂解,将RNP与抗体、微珠连接

Step3:微珠-抗体-RNP形成沉淀

Step4:将RNP从微珠-抗体上洗脱,并将RNA与蛋白解交联,纯化RNA

Step5:qPCR检测或测序分析

RNA Pulldown

RNA Pulldown是研究RNA与蛋白质相互作用的一种技术。利用生物素标记的RNA探针,通过与含有目的蛋白的溶液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。复合物可以特异性结合磁珠,从而与孵育液中的其他蛋白分离。复合物洗脱后,通过蛋白凝胶电泳实验,检测特定的RNA与蛋白的结合情况。

实验方法

Step1:生物素标记目标目标RNA

Step2:磁珠结合目标RNA

Step3:目标RNA与蛋白结合

Step4:通过磁场固定磁珠,将蛋白分离纯化

Step5:通过WB鉴定或质谱检测

GST Pulldown

GST Pulldown将靶蛋白-GST(Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶)融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用,用于验证两个已知蛋白的相互作用,或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验方法

Step1:Glutathione琼脂糖珠预处理;

Step2:GST融合蛋白挂柱

Step3:细胞裂解

Step4:将细胞裂解液上清加入beads;

Step5:加上SDS上样缓冲液;

Step6:SDS-PAGE,Western Blot或者质谱仪分析。

案例展示

ChIP

ChIP案例分析

1. 阳性对照组条带清晰可见,阴性对照组正常,表明CHIP实验操作可行。

2. input对照组条带清晰可见,表明PCR扩增引物可用。

3. 抗体A实验组有目的条带,表明基因与转录抑制因子蛋白均可发生结合。

RIP

RIP案例分析

1. 阳性对照组条带清晰可见,阴性对照组正常,表明RIP实验操作可行。

2. input对照组条带清晰可见,表明PCR扩增引物可用。

3. 抗体A实验组有目的条带,表明RNA与蛋白可发生结合。